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  3. 如何分析電泳

    在凝膠電泳儀中,DNA或蛋白質樣品的分離(通?;诖笮。┦峭ㄟ^施加電場使它們遷移通過凝膠來分離的。凝膠電泳在生物醫學研究實驗室中是常規操作,可用于回答各種不同的問題,因此,實際上并沒有一種通用的方法來分析結果。

    例如,諸如蛋白質印跡,RNA印跡和DNA印跡的不同技術都涉及凝膠電泳。

    如果您要進行DNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳(**常見的一種方法),通常需要至少做兩件事:1)區分未切割的質粒與插入片段,帶切口的質粒和切割的質粒,以及2)估計使用標準曲線Excel或計算器計算各種DNA片段的大小。

    運作方式如下。

    檢查您的實驗室筆記本以確定哪些樣品已裝入哪些通道。當裝載凝膠孔時,您應該注意每個泳道/樣品的身份。

    確定哪個泳道包含DNA標準的“階梯”。這些是已知長度的片段。它們的遷移距離可用于通過標準曲線Excel或其他計算器確定樣品片段的大小。

    用尺子測量從孔到跟蹤染料的圖像距離,該染料比任何DNA條帶都行進的距離遠(換句話說,它將位于凝膠的底部)。記錄此數字-您使用的單位并不重要。

    測量照片上從孔到“階梯”中每個帶的距離,然后用該距離除以跟蹤染料帶所經過的距離。此計算為您提供每個頻段的相對遷移率。

    示例:假設跟蹤染料帶移動了6英寸,而我們有三個帶移動了5、4.5和3.5英寸。

    他們的相對流動性是什么?答:我們將5、4.5和3.5除以6得到的相對遷移率分別為0.833、0.75和0.5833。

    將相對遷移率輸入到電子表格程序(Excel或您使用的任何其他類似程序)中,并將階梯中每個片段的大?。ㄒ郧A基為單位)一起輸入。

    制造商會為您提供他們提供的梯子中每個碎片的大小,因此您應該已經有了此信息。

    在x上繪制具有相對移動性的數據,在y上繪制以千為單位的大小的數據。

    在電子表格程序上使用趨勢線函數將方程擬合到數據中。該方程式應為冪方程式(例如x ^ -2),并且應相對較好地擬合數據(R系數至少為0.9)。這將創建一條曲線和一個標準曲線Excel。

    查看與您的樣本相對應的譜帶。

    請記住,較小的DNA片段比較大的DNA片段穿過凝膠的距離更遠,因此**靠近跟蹤染料的片段將**小。但是請注意,如果未切割質粒(環狀)DNA,它將像電話線一樣“超螺旋”或扭曲,這實際上會使它比相同大小的線性DNA 傳播得更遠。

    同樣,未完全切割的“切口”質粒將比相同大小的線性DNA 傳播更短的距離。因此,您無法從凝膠中估計未切割質粒的大小。

    將每個泳道中的條帶與您在該泳道中加載的樣品的標識相匹配,并確定您所看到的是否是您所期望的。這將取決于實驗的性質。

    但是,一般來說,如果您用兩種限制性酶消化插入質粒,則可以預期該插入物中將沒有質粒。

    由于它比質粒小得多,您可能會在該泳道中看到兩條帶,一條靠近頂部,而另一條靠近底部。僅用一種限制酶切割的質粒應僅形成一條條帶,該條帶比用兩種限制酶切割的質粒行進的距離要遠一些,但不能遠至插入片段。

    測量從孔到切出的質粒的距離,并用尺子插入條帶。將這些數字除以跟蹤染料的行進距離,即可得出插入片段和切割質粒的相對遷移率。

    將插入片段和剪切質粒的相對遷移率插入電子表格程序為您計算的方程式中。這種計算應給您估計這些質粒的大小。

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